Trong giai đoạn từ tháng 3/2013 đến tháng 3/2015, nhóm nghiên cứu do TS. Nguyễn Việt Linh, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đứng đầu đã thực hiện công trình nghiên cứu ảnh hưởng của giọt noãn bào chất đơn tinh lên sự hoạt hóa trứng và sự phát triển của phôi với mục tiêu tạo được tiền đề cho phát triển các nghiên cứu cơ bản về các quá trình hoạt hóa của tiền nhân đực và cái trong quá trình thụ tinh trong giai đoạn tiếp theo, là nền tảng để phát triển ứng dụng công nghệ thụ tinh ống nghiệm gián tiếp nâng cao hiệu suất tạo phôi các giống loại đặc hữu, quý hiếm, trứng động vật đã qua bảo quản lạnh, đóng gói hữu hiệu vào bảo tồn đa đạng sinh học động vật nuôi và động vật hoang dã. Đồng thời đánh giá được khả năng hoạt hóa trứng chưa thụ tinh của giọt noãn bào chất, ảnh hưởng của các yếu tố thời gian thụ tinh dung hợp, số lượng giọt noãn bào được dung hợp tới hiệu quả hoạt hóa trứng. Khảo sát khả năng tạo phôi, chất lượng phôi thụ tinh ống nghiệm gián tiếp. Xây dựng được phương pháp thụ tinh ống nghiệm gián tiếp áp dụng cho trứng lợn nuôi thành thục in vitro.
Các kết quả nghiên cứu đã được công bố trên tạp chí quốc tế như tạp chí Theriogenology- tạp chí chuyên sâu uy tín trong lĩnh vực sinh sản và phát triển, tạp chí Reproduction - tạp chí chuyên ngành với chỉ số ảnh hưởng cao trong lĩnh vực sinh sản và phát triển và tạp chí khoa học và công nghệ Thái Nguyên, Hội nghị Chăn nuôi - thú y toàn quốc 2015.
Các nội dung nghiên cứu chủ yếu bao gồm: Nghiên cứu tổng quan về sự hình thành và phát triển tế bào trứng lợn và thụ tinh ống nghiệm ở lợn, nghiên cứu chuẩn hóa kỹ thuật tạo giọt noãn bào chất từ trứng đã thụ tinh, nghiên cứu khả năng hoạt hóa trứng của các giọt noãn bào chất tạo ra từ trứng đã thụ tinh, nghiên cứu khả năng phát triển của phôi sau thụ tinh ống nghiệm gián tiếp và đánh giá chất lượng phôi thụ tinh ống nghiệm gián tiếp thông qua kiểu nhân và chất lượng phôi nang bằng số lượng tế bào.
Qua quá trình nghiên cứu chuẩn hóa kỹ thuật tạo giọt noãn bào chất (GNBC) từ trứng đã thụ tinh, nhóm nghiên cứu cho biết, thí nghiệm được tiến hành với thời gian của lần ly tâm thứ nhất là 9 phút, tốc độ 13000g, lần ly tâm thứ 2 với 3 phân lớp Percoll với lượng 100 µl mỗi lớp, các trứng được đặt lên mặt trên cùng của lớp Percoll có nồng độ thấp nhất. Thời gian thụ tinh càng lâu thì số GNBC có chứa tinh trùng càng tăng lên, nhưng tỷ lệ GNBC đơn tinh trùng chỉ tăng đến giá trị cao nhất là 37,2% tại thời điểm 3 giờ sau thụ tinh, sau đó giảm dần. Nhóm nghiên cứu quyết định chọn thời gian thụ tinh tối ưu cho thí nghiệm là 3 giờ. Độ phân ly của noãn bào chất tăng dần khi tăng thời gian ly tâm, tuy nhiên tỷ lệ GNBC có chứa và không chứa tinh trùng, cũng như tỷ lệ GNBC đơn tinh trùng không thay đổi có ý nghĩa thống kê khi thay đổi thời gian ly tâm. Khi ly tâm đến phút thứ 9 trở đi xuất hiện sự phân hóa của các GNBC thành 2-3 loại có màu sắc và kích thước khác nhau. Sự thụ tinh của các trứng được tái tạo từ GNBC có hàm lượng ty thể khác nhau. Do đó, để tạo ra GNBC đơn tinh thì phương pháp tối ưu nhất là thời gian thụ tinh trong 3 giờ, sau đó ly tâm lần 1 trong 9 phút, lần 2 trong vòng 4 giây.
Quá trình nghiên cứu khả năng hoạt hóa trứng của các GNBC tạo ra từ trứng đã thụ tinh và khả năng phát triển của phôi sau TTON gián tiếp cho thấy, với thời gian thụ tinh 2 giờ, khả năng hoạt hóa của GNBC bị hạn chế với GNBC có hoặc không có tinh trùng. Khi thời gian tăng lên 2,5 giờ, khả năng này tăng 90% và không đổi dù thời gian thụ tinh có tăng lên 3,5 giờ. Như vậy, nhóm nghiên cứu thấy rằng ở tại thời điểm 2,5 giờ sau khi dẫn tinh, các trứng về cơ bản đã được thụ tinh và toàn bộ noãn bào chất, cả phần xung quanh tinh trùng lẫn phần nằm xa tinh trùng-thể hiện qua các GNBC sử dụng trong thí nghiệm này, đã được hoạt hóa các phản ứng sau khi thụ tinh, sẵn sàng cho các quá trình hoạt động của hợp tử.
Việc khảo sát khả năng hoạt hóa trứng của các loại giọt noãn bào chất khác nhau cũng được tiến hành thí nghiệm với thời gian ly tâm lần thứ nhất là 9, tốc độ 13000g, lần ly tâm thứ 2 với 3 phân lớp Percoll với lượng 100 µl mỗi lớp, các trứng được đặt lên mặt trên cùng của lớp Percoll có nồng độ thấp nhất. Các GNBC được phân loại với các tiêu chí có chứa và không chứa đĩa gian kỳ 2, có chứa và không chứa tinh trùng, sau đó được sử dụng để dung hợp với các trứng thành thục đã được tách tế bào cận não và màng sáng và được xử lý với phyto-hematoglutinin trong môi trường 199 vod bổ sung HEPES. Kết quả là, khả năng hoạt hóa trứng của các GNBC khác nhau gần như không khác biệt, hầu như không phụ thuộc vào sự có mặt hoặc sự vắng mặt của đĩa gian kỳ 2 của trứng cho hay sự có mặt hoặc vắng mặt của tinh trùng cũng như số lượng tinh trùng.
Đối với các kết quả về nghiên cứu khả năng phát triển của phôi sau TTON gián tiếp cho thấy: Trứng trần kích thích mẫu sinh bằng xung điện (đối chứng 1) là 66/122 mẫu nghiên cứu, khả năng phân chia của trứng kích thích mẫu sinh và thụ tinh ống nghiệm đơn tinh gián tiếp là 47/122 và 36/122; Trứng trần thụ tinh ống nghiệm trực tiếp (đối chứng 2) là 87/137 mẫu nghiên cứu, khả năng phân chia của trứng kích thích mẫu sinh và thụ tinh ống nghiệm đơn tinh gián tiếp là 46/137 và 31/137; Trứng kích thích mẫu sinh bằng dung hợp với GNBC là 32/118 mẫu nghiên cứu , khả năng phân chia của trứng kích thích mẫu sinh và thụ tinh ống nghiệm đơn tinh gián tiếp là 30/118 và 19/118; Trứng thụ tinh ống nghiệm gián tiếp là 30/114 mẫu nghiên cứu, khả năng phân chia của trứng kích thích mẫu sinh và thụ tinh ống nghiệm đơn tinh gián tiếp là 27/114 và 14/114. Các thí nghiêm đều được lặp từ 5-7 lần, tỷ lệ sai khác p <0,05.
Về chất lượng phôi thụ tinh ống nghiệm gián tiếp cho thấy: Trứng trần TTON trực tiếp (đối chứng 2) với số lượng 45 số phôi dâu, phôi nang đưa vào nghiên cứu đạt được số tế bào được số nhiễm sắc thể là 189%, số tế bào mang bộ nhiễm sắc thể bình thường là 183 (chiếm 97,8%); Trứng TTON gián tiếp với số lượng là 5 số phôi dâu, phôi nang đưa vào nghiên cứu đạt được số tế bào được số nhiễm sắc thể là 22%, số tế bào mang bộ nhiễm sắc thể bình thường là 21 (chiếm 95,5%). Từ kết quả này, có thể thấy rằng TTON gián tiếp không làm ảnh hưởng đến độ ổn định số lượng của bộ nhiễm sắc thể đặc trưng của loài. Tuy nhiên, do số phôi dân và phôi năng thu được còn hạn chế nên vẫn cần tiến hành nghiên cứu thêm để có thể khẳng định chắc chắn.
Chất lượng của phôi thu được từ các phương pháp trực tiếp đều tốt (đều trên 40 tế bào/ phôi), có thể phát triển thành con con sau khi được cấy chuyển phôi. Động học của ty thể trong quá trình TTON gián tiếp là khá tương đồng với quá trình TTON trực tiếp. Nồng độ của ATP nội bào của trứng sau khi thụ tinh được đo bằng phương pháp dựa trên phản ứng luciferin-luciferase bằng bộ kit FL-ASC của hãng Sigma hầu như không có sự sai khác với nhau tại các thời điểm khác nhau.
Như vậy, đề tài đã góp phần tạo nguồn nguyên liệu trứng lợn thành thục phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực công nghệ Phôi trên động vật có vú, đặc biệt là lợn. Góp phần hoàn thiện thệ thống IVF trong điều kiện việt Nam. Cung cấp nguồn nguyên liệu tế bào phôi chất lượng tốt phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo đặc biệt theo hướng y sinh.
Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 10888) tại Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia.
Nguồn: P.T.T (NASATI)